Stałą dysocjacji substratu enzymu trudno jest zmierzyć bezpośrednio, ponieważ kompleks enzym-substrat jest krótkotrwały i ulega reakcji chemicznej, tworząc produkt. I jest oznaczony przez Ki'. Stała dysocjacji substratu enzymu jest zwykle mierzona przy użyciu mole/litr dla Stężenie molowe. Należy pamiętać, że wartość Stała dysocjacji substratu enzymu to zawsze negatywny.